液相方法開發(fā)指南-反相色譜

前言

近數(shù)年國內(nèi)藥物研發(fā)風(fēng)生水起，十分火爆，而藥物研發(fā)的分析領(lǐng)域必然經(jīng)常需要開發(fā)HPLC檢測方法， HPLC較常用的是反相色譜。本文力求從實(shí)戰(zhàn)中闡述理論，在實(shí)戰(zhàn)中總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，使得看完本文的讀者就能對自己實(shí)際工作中的方法開發(fā)有一個初步的構(gòu)想。R-HPLC方法開發(fā)一般包含四大塊的內(nèi)容：檢測波長、色譜柱、樣品處理、流動相。下文將主要從這四個方面闡述在方法開發(fā)中如何選擇上述參數(shù)。

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檢測波長

1.1閑述

紫外檢測器是液相中常用的檢測器，絕大部分藥物在該檢測器中有響應(yīng)，所以本文僅闡述使用紫外檢測器如何確定檢測波長，其他檢測器的使用將另行說明。

1.2常見做法

目前常見的做法是用選定的稀釋劑或者某個溶劑將樣品溶解，然后在紫外光譜儀中進(jìn)行全波長掃描，得到各組分的光譜，并確定方法的檢測波長。

很遺憾的說，上面的做法不正確。我們可以想象，當(dāng)組分進(jìn)入檢測器時(shí)，它是處在流動相中的，也就是說各組分在HPLC中的光譜表現(xiàn)是在流動相中的光譜表現(xiàn)。紫外吸收光譜有一個術(shù)語叫“溶劑效應(yīng)”，是指受溶劑的極性或酸堿性的影響，使溶質(zhì)吸收峰的波長、強(qiáng)度和形狀發(fā)生不同程度的變化。這就意味著如果溶劑與流動相不一樣，則上述的光譜和各組分實(shí)際在HPLC中的光譜很可能是不一致的。比如某些易解離化合物在不同pH值的溶劑中，大吸收波長不一樣。

1.3如何確定檢測波長

使用二極管陣列檢測器（開發(fā)方法的時(shí)候優(yōu)先選擇該檢測器）按照確定的方法進(jìn)樣分析，獲得各組分的光譜圖，檢測波長一般選擇主成份的波峰或者波谷處。因?yàn)樵诓ǚ寤蛘卟ü忍庉^為平坦，波長的少許偏差響應(yīng)相差不大，方法在波長這一塊的耐用性較好，而在坡上則正好相反。如果是多組分含量測定，比如復(fù)方制劑的含量測定，可以使用二極管陣列檢測器，分別調(diào)取不同組分的大吸收波長響應(yīng)數(shù)據(jù)。

在有關(guān)物質(zhì)的檢測波長選擇中，有一種常見做法是將各個組分的光譜圖疊在一起，選擇交叉處，因?yàn)樵撎幍母鹘M分響應(yīng)接近，即校正因子將都接近1。這種做法并不提倡，因?yàn)榻徊嫣幋蠖喑鲇谄律?，檢測波長的變動將帶來響應(yīng)值的巨大變化，方法的耐用性非常差，甚至可能導(dǎo)致各組分的響應(yīng)非常不穩(wěn)定。建議波長選擇主峰的波峰或者波谷，因?yàn)橛嘘P(guān)物質(zhì)大部分結(jié)構(gòu)與主成份類似，光譜行為接近，如有結(jié)構(gòu)與主成份相差較大，響應(yīng)也相差很大，可以單獨(dú)制定控制方法（如外標(biāo)法）。

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色譜柱

應(yīng)根據(jù)進(jìn)樣量、樣品性質(zhì)、儀器狀態(tài)、其他組分和流動相等情況選擇相應(yīng)的色譜柱。

2.1進(jìn)樣量

如有關(guān)物質(zhì)方法，各組分響應(yīng)較弱，為滿足靈敏度的要求，進(jìn)樣量較大，則需考慮色譜柱應(yīng)滿足荷載的要求，避免進(jìn)樣量大導(dǎo)致的柱過載使主峰展寬變形。一般這種情況大多選用大載碳量的25×0.46cm或更大規(guī)格柱，盡可能提高柱荷載。與此相對，含量測定方法一般進(jìn)樣量較小，為減少分析時(shí)間可以選擇較短的色譜柱。

2.2樣品性質(zhì)

反相色譜使用的色譜柱大多是烷基鍵合硅膠，如C18、C8、苯基柱等。硅膠上有硅羥基，硅羥基會電離成硅氧負(fù)離子。如果供試品為堿性化合物，如鹽酸厄洛替尼，弱堿強(qiáng)酸鹽，則厄洛替尼除了會與鍵合相產(chǎn)生“相似相容”的反相色譜保留作用外，還會與硅氧負(fù)離子產(chǎn)生離子色譜的保留作用，即“二次保留”，導(dǎo)致厄洛替尼峰拖尾。

解決堿性化合物拖尾有兩個辦法，一個是在流動相中加入掃尾劑，相應(yīng)內(nèi)容見“流動相”。另一種方法是選擇“封尾（也稱封端）”處理的色譜柱。所謂封尾，是因?yàn)殒I合相一般體積較大，C18、C8、苯基等，因空間位阻使得硅膠上硅氧負(fù)離子不能*被鍵合，所以用小分子烷烴與硅膠上殘余的硅羥基鍵合，減少硅氧負(fù)離子的數(shù)量。一般在開發(fā)堿性化合物液相方法時(shí)選擇封尾處理的色譜柱，具體封尾柱的型號見供應(yīng)商說明書。

酸性和中性化合物選擇色譜柱不用考慮硅氧負(fù)離子的影響。

2.3儀器狀態(tài)

選擇色譜柱時(shí)，還需考慮儀器是否匹配，選擇小粒徑或小口徑色譜柱，應(yīng)評估儀器的大耐受壓力是否符合要求。如選擇快速分析柱（短、小粒徑、小口徑），應(yīng)考慮柱外死體積引入的峰展寬，這種情況下建議選擇同一廠家的儀器與色譜柱，避免接頭不匹配增加死體積。

2.4其他組分

如膠囊的溶出檢測中，使用C18柱如果發(fā)現(xiàn)多次檢測后主成分峰變形，一般是因?yàn)槟z囊殼中存在強(qiáng)保留組分，可以選擇另一種保留機(jī)制的色譜柱如氰基柱或氨基柱等。不同類型鍵合相保留機(jī)制各有不同，篇幅有限，另行說明吧（又挖個坑）。比如苯環(huán)上的細(xì)微差別，如多了個鹵素，C18柱分不開，可以選擇苯基柱，苯基柱對于苯環(huán)上細(xì)微差別有良好的分離效果。某些組分分離效果非常差，可以考慮換一個型號的色譜柱，比如從島津的ODS-2換成安捷倫的XDB-C18，不同型號的色譜柱因?yàn)楣に嚨牟顒e選擇性也是有差別的，這沒有規(guī)律，只能是通過實(shí)驗(yàn)來確認(rèn)適用的色譜柱。

2.5流動相

應(yīng)選擇與擬定流動相匹配的色譜柱，增加色譜柱使用壽命。如流動相含0.1%磷酸，就應(yīng)選擇耐酸柱；反之如流動相pH較高（＞7），應(yīng)選擇耐堿柱。具體哪些型號色譜柱耐酸或耐堿，見供應(yīng)商說明書。

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樣品處理3.1稀釋劑選擇

稀釋劑不是只把樣品溶解就可以了，需要考慮“溶劑效應(yīng)”，此溶劑效應(yīng)與上文紫外光譜的溶劑效應(yīng)不是同一個含義。溶劑效應(yīng)的具體概念及詳細(xì)分析請見拙著《論液相色譜的溶劑效應(yīng)》，不再贅述。選擇稀釋劑時(shí)，稀釋劑在滿足溶解供試品的前提下，應(yīng)盡可能與流動相性質(zhì)接近，在有機(jī)相比例、pH值等方面，但是一般很少選擇流動相作為稀釋劑，因?yàn)榱鲃酉嗯渲戚^為麻煩，選擇流動相作為稀釋劑增加了工作量；還有就是很多流動相中含有緩沖鹽，如果選為稀釋劑，供試品溶液在進(jìn)樣器中產(chǎn)生高壓鹽析現(xiàn)象，固體鹽顆粒會損壞進(jìn)樣器。稀釋劑一般選擇同初始比例的有機(jī)相-水系統(tǒng)。如果不溶解，需要用其他溶劑溶解的話，建議使用前述的有機(jī)相水系統(tǒng)稀釋10倍以上。絕不能直接用其他溶劑溶解，然后進(jìn)樣分析，因?yàn)楹芸赡墚a(chǎn)生溶劑效應(yīng)和樣品析出堵塞儀器。易解離化合物可以在稀釋劑中加入鹽酸或者氫氧化鈉助溶。

補(bǔ)充說明，一般保留時(shí)間短的組分容易出現(xiàn)溶劑效應(yīng)，減少溶劑效應(yīng)可以采取的措施有減少進(jìn)樣量、增強(qiáng)保留、改變稀釋劑、優(yōu)化流動相。優(yōu)化流動相是因?yàn)槿軇┬?yīng)是稀釋劑和流動相相差性質(zhì)較大導(dǎo)致的結(jié)果，也就是二者的相互作用導(dǎo)致的，所以可以通過優(yōu)化流動相來消除溶劑效應(yīng)。

3.2供試品濃度

有關(guān)物質(zhì)方法應(yīng)考慮方法的靈敏度，一般主成份峰的響應(yīng)值應(yīng)不低于1000，并將供試品溶液稀釋一萬倍后信噪比應(yīng)不低于10。含量測定方法應(yīng)考慮主成分峰在線性范圍內(nèi)，不能分離的雜質(zhì)峰在規(guī)定濃度下應(yīng)可以忽略不計(jì)。

3.3供試品處理方法

如果供試品的處理方法畢竟特殊，還需要在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定特殊的處理方法，則需要對供試品的處理進(jìn)行相應(yīng)的研究。比如片劑的含量測定，直接投片、研成細(xì)粉、除去包衣再研成細(xì)粉、超聲及時(shí)間、震搖及時(shí)間、濾膜吸附、離心等等。這些處理方法都需要進(jìn)行相應(yīng)的研究，以保證樣品的處理符合檢測的需要。比如說片劑含量實(shí)際是100%，而檢測結(jié)果卻是90%，色譜條件沒有問題，問題出在供試品處理時(shí)提取不*。

3.4 衍生化

某些情況下樣品需要衍生化才能滿足質(zhì)量控制的要求，如保留太弱、沒有響應(yīng)、異構(gòu)體無法分離等。

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流動相

4.1流動相的種類

反相色譜的流動相主要是兩大類：水相和有機(jī)相。水相主要分為兩種：純水和緩沖鹽；有機(jī)相常用的是乙腈和甲醇，其他還有乙醇、異丙醇等。

4.1.1 什么情況下用純凈水

供試品和主要雜質(zhì)都是中性化合物（即不會電離或者不易電離）的情況下，流動相可以用純水-有機(jī)相系統(tǒng)，這種情況不多，所以大多數(shù)都用了緩沖鹽。

4.1.2  什么情況下用緩沖鹽

供試品或主要雜質(zhì)為易解離化合物，如鹽酸厄洛替尼、帕瑞昔布鈉等一看就是能電離的，根本不用考慮純水，流動相需要使用緩沖鹽。易解離化合物的相關(guān)內(nèi)容見《易解離化合物的pKa、離子型、分子型及其HPLC保留特征》，緩沖鹽使用的詳細(xì)內(nèi)容見拙著《方法開發(fā)緩沖鹽選擇指導(dǎo)原則》，本文不再贅述。

4.1.3 如何選擇有機(jī)相

一般是根據(jù)組分的分離情況、截止波長、壓力等因素選擇有機(jī)相。比如甲醇和乙腈，二者的性質(zhì)不一樣，甲醇有氫鍵，乙腈是偶極矩，在組分間的選擇性不一樣，甲醇分不開的組分可能乙腈能分開，乙腈分不開的組分可能甲醇能分開。低波長下如205nm一般應(yīng)選擇乙腈，乙腈的截止波長較低，在低波長下基線較平坦，此時(shí)不應(yīng)選擇乙醇等溶劑。乙腈作為流動相產(chǎn)生的壓力一般也小于甲醇、乙醇等溶劑，如果超過系統(tǒng)允許大壓力的風(fēng)險(xiǎn)較高，應(yīng)選擇乙腈作為流動相。流動相常用有機(jī)溶劑截止波長親們需要去了解，方法選定的波長應(yīng)遠(yuǎn)大于流動相的截止波長。

4.2 如何確定流動相比例和梯度

有兩種做法，一種是設(shè)置一個60分鐘有機(jī)相比例從5%到100%的梯度，并根據(jù)此梯度下各組分的保留的情況決定下一步的優(yōu)化策略。不過實(shí)際工作中這么做耗時(shí)太久，推薦做法是等度逐漸降低有機(jī)相比例確定各組分的保留情況，并根據(jù)等度研究的結(jié)果確定是否采用梯度及梯度情況。

舉例如下：需要建立一個有關(guān)物質(zhì)檢測方法，有A、B、C、D、E5個組分，極性依次增大（分析人員應(yīng)能做到看化合物結(jié)構(gòu)式就能判斷其極性的相對大小，這對有機(jī)化學(xué)的功底有一定的要求），即在反相色譜中保留依次減小。首先用80%有機(jī)相分析A， k值為1；分析B，無保留。則CDE三個保留更弱的組分在該條件下沒有必要進(jìn)樣。

因?yàn)锽無保留，所以有機(jī)相應(yīng)直接減少20%，改變條件為60%有機(jī)相，分析B，k值為0.5；此時(shí)需要注意一個反相色譜的一個規(guī)則“三倍規(guī)則”，即有機(jī)相比例減少10%，保留值增加2-3倍。該規(guī)則可以準(zhǔn)確預(yù)測中性化合物隨有機(jī)相比例變化的保留情況，易解離化合物因?yàn)楸Ａ糨^為復(fù)雜，可能會有偏差。改變條件為50%有機(jī)相，分析C……分析E的時(shí)候有機(jī)相比例30%，k值為1。

上述的研究就讓我們對5個組分的保留有了一個直觀的了解，必須走梯度，梯度下限應(yīng)不大于30%，上限應(yīng)不小于80%，我們可以設(shè)置梯度為25分鐘從30%升到80%保留5分鐘，然后確定各組分在該梯度下的分離情況，必要的話進(jìn)行調(diào)整。這么做的好處是速度快，一般來說順利的話一個上午可以完成各組分等度研究，下午確定梯度分離情況，一天完成一個有關(guān)物質(zhì)方法的開發(fā)；另一個好處就是在等度研究時(shí)就可以確認(rèn)各組分分離情況了，很快就能發(fā)現(xiàn)難分離組分。

4.3添加劑

  4.3.1  掃尾劑

上文說到的堿性化合物因硅氧負(fù)離子的二次保留導(dǎo)致的拖尾，常用二乙胺、三乙胺等小分子有機(jī)胺類化合物飽和硅氧負(fù)離子，使其不能與目標(biāo)化合物產(chǎn)生二次保留。二乙胺、三乙胺一般被稱為“掃尾劑”。不建議在流動相中使用掃尾劑，因?yàn)槭褂弥罅鲃酉嗳菀鬃冑|(zhì)，噪音變大，且易出鬼峰。一般情況下使用封尾處理的色譜柱可以達(dá)到相同的效果。

    4.3.2  離子對試劑

如供試品中有強(qiáng)離子化傾向的組分，保留非常弱，為了增強(qiáng)其保留，可以在流動相中加入相應(yīng)的離子對試劑如氫氧化四丁基銨、十二烷基硫酸鈉等。它的原理就是流動相相中的離子對試劑的非極性基團(tuán)與反相鍵合相結(jié)合，其離子化基團(tuán)與強(qiáng)離子化組分陰陽離子相互吸引，增強(qiáng)強(qiáng)離子化組分的保留。如小分子強(qiáng)堿性化合物，如在流動相中加入十二烷基硫酸鈉，十二烷基與色譜柱的C18結(jié)合，硫酸陰離子與該化合物形成離子間的保留，極大增強(qiáng)了該化合物的保留。

離子對色譜中即有反相色譜的保留機(jī)制，又有離子色譜的保留機(jī)制。它的保留呈現(xiàn)以下的規(guī)律：強(qiáng)離子化組分的保留隨離子對試劑的濃度增加而增加，隨pH值的變化而變化，即可以通過調(diào)節(jié)離子對試劑的濃度和pH值改變強(qiáng)離子化組分的保留。其他中性組分隨離子對試劑的濃度增加保留可能略有減少，反離子組分的保留極大減少。

加入離子對試劑的缺點(diǎn)是流動相容易變質(zhì)，污染色譜柱，平衡時(shí)間非常長，基線較差等。所以除非有上述存在強(qiáng)離子化傾向的組分，一般我不愿意使用離子對試劑。

   4.3.3 手性添加劑

可以在流動相中加入手性添加劑實(shí)現(xiàn)在反相色譜中分離手性異構(gòu)體，當(dāng)然這是比較冷門的做法，有興趣可以了解，一般不大用。使用手性色譜柱分析手性異構(gòu)體是常用的方法。

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其他

方法開發(fā)時(shí)應(yīng)選擇二極管陣列檢測器，在方法開發(fā)過程中考察各組分的峰純度，獲得各組分的光譜圖。

方法確定后應(yīng)進(jìn)行初步的驗(yàn)證，如降解試驗(yàn)，確認(rèn)降解產(chǎn)物是否能夠分開。降解試驗(yàn)的做法見拙著《分析方法學(xué)驗(yàn)證技巧與重點(diǎn)》。

方法開發(fā)是一個持續(xù)的過程，應(yīng)在工作中持續(xù)評估方法的有效性和合理性。如本人曾經(jīng)有一個項(xiàng)目在很后期才發(fā)現(xiàn)片劑經(jīng)研磨后含量測定的結(jié)果低了3個點(diǎn)，然后將供試品處理改成直接投片。